蟾酥丸中蟾蜍二烯内酯类成分的含量测定

摘要：用高效液相色谱法分离测定蟾蜍丸中2种蟾蜍二烯内酯类化合物: 华蟾毒它灵、脂蟾毒配基成分含量。方法：利用高效液相色谱仪定量检测,以Agilent Zorbax SB-C18( 250mm×416mm, 5µm)色谱柱。流动相：乙腈- 0.5%磷酸二氢钾溶液 (55:45，用磷酸调节pH为3.2)；检测波长：296 nm。

采用高效液相色谱法可以同时测定2种蟾蜍二烯内酯类化合物的含量。该测定方法简便、可靠、准确，分离效果好，灵敏度高，适用于蟾酥丸蟾蜍二烯内酯类化合物的质量控制。对2家医疗机构、2批号样品中2种蟾蜍二烯内酯的含量准确测定了结果。

关键词 蟾蜍丸，蟾蜍二烯内酯，高效液相色谱法

一、蟾蜍二烯内酯类成分含量测定的目的和意义

中成药蟾酥丸具有解毒消肿，辟秽疗疮，活血定痛等特点。主治疔毒恶疮、痈疽发背、附骨痈疽、乳痈乳发及无名肿毒等。现代多用于急性乳腺炎、蜂窝组织炎、全身各部的化脓性感染等属于热毒壅盛者。蟾酥丸组方成分一般为：蟾酥、雄黄、朱砂、轻粉、寒水石、枯矾、铜绿、蜗牛、麝香、胆矾、乳香、没药。其中蟾酥是蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥分泌物，性辛，温;有毒。归心经。具有解毒，止痛，开窍醒神之功效。。蟾酥中含有蟾蜍毒素类、蟾毒配基类、蟾毒色胺类等化学成分, 此类物质有强心等作用，在化学上属于甾族化合物，而其C17上再接一个α-吡喃酮基，凡具有此种骨架的物质(实际上，植物中亦有具有此种骨架的物质)，总名蟾蜍二烯内酯，是蟾蜍浆液、蟾酥的主要有效成分。蟾酥中所含的蟾蜍二烯内酯有：①华蟾毒它灵；②蟾毒灵；③脂蟾毒配基；④华蟾毒配基等。蟾酥具有毒性, 为保证用药安全, 必须对其进行质量控制。

文献报道蟾蜍丸中蟾酥的含量测定方法主要为控制蟾毒内酯成分的总含量或测定某一种蟾蜍二烯内酯类成分，采用的方法有紫外法、二阶导数光谱法、薄层法、高效液相色谱法等。本实验采用2010版药典对蟾酥的成分测量方法-高效液相色谱法，同时测定2种蟾蜍二烯内酯的含量，该方法简便、准确, 重复性好, 可用于蟾酥丸的质量控制。通过测定不同配伍方中化学成分的含量差异，可以从化学物质基础的角度揭示中药配伍减毒增效的合理性。本实验将高效液相色谱法应用于不同2家中医院配制的蟾酥丸中2 种蟾蜍二烯内酯类化合物的含量测定中，为其配伍研究提供参考。

二、蟾蜍二烯内酯类成分含量测定的实验仪器与材料

（一）仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪, 二极管阵列检测器, ChemStation色谱工作站。Millipore Milli-Q纯水器; METTLER万分之一及十万分之一电子天平; 离心机TDL-5-A ( 上海安亭科学仪器厂)。

乙腈(Fisher公司，色谱纯)，磷酸二氢钾(湖州化学试剂厂，分析纯)；华蟾毒它灵(Cinobufotalin，上海哈灵生物科技有限公司，批号8525-121112)，脂蟾毒配基(中国药品生物制品检定所1302-9306)。流动相用水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

（二）待测样品

待测样品来自①南京轩德堂中医配制蟾酥丸，批号：121201；②南京中医药大学附属医院配制蟾酥丸，批号130402。各样品经研钵研成粉末，40目筛过滤，密闭保存。

取本品细粉约200mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，超声处理30min，过滤，残渣加入3ml甲醇，再如上重复提取2次，合并滤液，转移至20 ml量瓶，用甲醇补足至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤后，取续滤液，即得待测样品溶液。

三、实验方法步骤

（一）色谱条件

采用Agilent Zorbax SB-C18( 250mm×416mm, 5µm)色谱柱。流动相：乙腈- 0.5%磷酸二氢钾溶液 (55:45，用磷酸调节pH为3.2)；检测波长：296 nm；流速：0.8 ml/min；柱温：40℃；进样体积：10μl。

（二）对照品溶液配制

取对照品华蟾毒它灵、脂蟾毒配基适量，分别精密称定，分别置于5ml量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为50μg/ml的标准品溶液，将该溶液作为标准对照品储备液。

（三）系统适应性测试

1.取对照品溶液, 在上述色谱条件下进样分析，理论板数按华蟾毒它灵及脂蟾毒配基分别计算均不低于5500。

2.华蟾毒它灵及脂蟾毒配基二者与相邻峰的分离度均大于1.5，其结果表明样品中其他成分对华蟾酥毒基及脂蟾毒配基的测定无干扰。

3. 分析拖尾因子（T）用于评价色谱峰的对称性。上述色谱条件下进样分析结果：拖尾因子在0.95~1.05之间。

（四）线性关系考察

取照品华蟾毒它灵、脂蟾毒配基适量，分别精密称定，制成含华蟾酥毒基200μg/ml、200μg/ml的混合溶液, 作为储备液。分别精密量取混合溶液1，2，5，10，20，25 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列质量浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取上述溶液各10μl ，按上述色谱条件进样分析。

（五）仪器精密度试验

取40μg/ml的华蟾毒它灵、脂蟾毒配基标准品溶液在上述色谱条件下，重复进样6次，按上述色谱条件测定峰面积。结果华蟾毒它灵、脂蟾毒配基的相对标准偏差RSD依次为2.1%、1.5%。

（六）稳定性试验

稳定性试验考察原料药或者药物制剂在温度，湿度，光线等影响下随时间变化规律。两种待测样品溶液，在0，3，6，9，12，15，18，21，24 h分别进样，按上述色谱条件分析，以峰面积计算相对标准偏差，RSD在0.9%~1.6%之间，表明2种待测样品至少在24 h内稳定。

（七）重复性试验

采用外标法评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。对同一样品蟾酥丸(批号:130402) 按待测样品测定项下进行5次平行测定，华蟾毒它灵和脂蟾毒配基的平均含量分别为1.126mg/g和2.092mg/g，RSD分别为1.3%和1.7%。

（八）回收率试验

采用加样回收法。精密称定已知华蟾毒它灵和脂蟾毒配基含量的蟾酥丸样品细粉约200mg (批号:130402) 6份研细，加入浓度为50μg/mL的标准品溶液适量，以使每种标准品的加入量依次为100μg、200μg、400μg，按待测样品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下测定，计算回收率，结果表明华蟾毒它灵在3个加样水平的回收率在97.6% ~101.2%之间，RSD为1.46%；脂蟾毒配基在3个加样水平的回收率在96.2%~100.6%之间，RSD为2.08%。

四、讨论

（一）超声波处理

在含量测定中，主要针对蟾酥丸中的主要成分设计和选择提取工艺。考察了索氏提取、回流和超声3种方法，并分别采用70%乙醇和甲醇两种溶剂。结果表明3种方法提取率相当。其中，索氏提取方法和回流方法相对复杂，在对蟾蜍二烯内酯类的提取方面没有显著优势，因此采用超声方法。乙醇提取液中所具有的色谱峰明显多于甲醇提取液分析得到的色谱峰。为了避免对测定造成无谓的干扰，简化提取工序，优选甲醇超声提取的方法作为提取方法。

本试验比较了不同超声时间(20、30、40、50、60 min)对待测样品提取的影响, 结果显示华蟾毒它灵和脂蟾毒配基的提取总量分别为3.359、3.426、3.485、3.482、3.472(mg/g)，表明超声时间30min就可以满足试验需要。

（二）流动相选择

试验中曾考察了以甲醇一水(60：40)、乙腈一水（50：50）等作为流动相。结果发现，华蟾毒它灵与脂蟾毒配基基线分离效果不佳。以乙腈- 0.5%磷酸二氢钾溶液 (55:45，用磷酸调节pH为3.2)为流动相，在偏酸性条件下，二者得到了很好的分离。

（三）检测波长

利用二极管阵列检测器的特点，绘出了对照品华蟾毒它灵、脂蟾毒配基对照品的紫外吸收图谱，结果表明华蟾毒它灵在293.1nm处有最大吸收，脂蟾毒配基在299.0nm处有最大吸收，且两者峰形平缓，考虑到同时测定2种成分，取两者的平均波长296.0 nm作为检测波长。

五、结论

采用高效液相色谱法同时测定2种蟾蜍二烯内酯类化合物的含量，：该测定方法简便、可靠、准确，分离效果好，灵敏度高。适用于蟾酥丸蟾蜍二烯内酯类化合物的质量控制。

对测得的2家医疗机构、2批号样品中2种蟾蜍二烯内酯的含量测定结果表明，不同企业之间的蟾酥丸中2种蟾蜍二烯内酯的含量存在差异，这可能与蟾酥在组方中的比例、原药材的选取或加工工艺的差异有关。

六、参考文献

[1]国家药典委员会编制：《中华人民共和国药典》，中国医药科技出版社，2012年10月；

[2]刘晓秋著：《中药有效成分含量测定》，人民卫生出版社, 2008年2月；

[3]姚彤炜主编：《药物分析》，浙江大学出版社，2011年5月；