摘要：阿糖胞苷（AraC）是目前治疗儿童急性髓性白血病有效手段之一。AraC在人体内的代谢途径是经细胞膜上的人类平衡型核苷转运体(human equilibra tive nucleoside transporter，hENT)进入细胞内，在脱氧胞苷激酶(DCK)的催化下形成一磷酸AraC(Ara—CMP)，再磷酸化形成具有生物活性的代谢产物Ara—CTP，从而发挥治疗作用，最后细胞内的AraC 又在胞苷脱氨酶(cytidine deaminase，CDA)的催化下水解脱氨转化为失活形式—AraU。整个代谢过程受hENT、DCK 、CDA三种代谢酶的影响，因此上述代谢酶的活性强弱是导致AraC耐药性的主要原因，直接影响了AraC临床治疗效果。其中DCK是AraC活化过程中的限速酶，hENT是AraC转运入细胞的载体，CDA可使体内的AraC水解脱氨基降解为AraU。通过对三种代谢酶对AraC临床疗效联合影响的研究发现白血病细胞DCK与CN11表达的比率作为预测AraC临床疗效的有效因素。
关键词 阿糖胞苷，儿童急性髓性白血病，活性研究，代谢酶，临床疗效
白血病是儿童最常见的恶性血液肿瘤，我国15岁以下小儿每年患白血病的发病数估计15000例，90%为急性白血病，其中急性髓性白血病占儿童白血病的30%。随着医学的进步，通过长期序贯联合化疗，大多数患儿可以获得完全缓解，其中急性髓性白血病的长期无病生存率可以40%以上，但AraC耐药性是治疗中的一大问题。AraC耐药机制是多方面的，而最有可能的原因与AraC的细胞内代谢酶密切相关。
一、儿童急性髓性白血病（AML）的诊断标准及治疗手段
（一）AML诊断标准
AML确诊主要依靠骨髓涂片检查和细胞组织化学。多数患儿骨髓有核细胞增生活跃，明显活跃或极度活跃，原始和幼稚细胞>30%，一般多在50%以上，极个别可能增生低下或不见幼稚细胞，再结合临床表现和并病史进行综合分析。血象、骨髓象、细胞免疫学等实验室检查有助于进一步确诊AML及AML分型。
（二）AML的治疗手段
目前治疗AML以化疗和干细胞移植为主。AML的化疗方案的选择要依据患儿年龄、全身状况、既往病史和既往药物治疗史而定。目前各家公认的儿童AML诱导缓解化疗方案为IA、DAE、MA、TA、HA、VM26+Ara-C、HD-Ara-C单用或联合蒽环类，m-AMSA，VP-16D等化疗方案。对于AML的干细胞移植治疗，多数人主张CR后进行骨髓移植，其中异基因骨髓移植效果最好，但HLA配型限制，难以寻找合适的供髓者，而自体骨髓移植复发率较高。
二、阿糖胞苷及其药理作用
（一）阿糖胞苷（cytosine arabinoside;araC）简介
阿糖胞苷是胞嘧啶与阿拉伯糖形成的糖苷化合物，是DNA聚合酶的竞争性抑制剂，抑制体内DNA生物合成。临床上被用做抗肿瘤，尤其是治疗白血病的药物。该药主要作用于细胞S增殖期的嘧啶类抗代谢药物，通过抑制细胞DNA的合成，干扰细胞的增殖。
（二）阿糖胞苷的药理作用
阿糖胞苷进入细胞后，先在细胞内经脱氧胞苷激酶催化磷酸化，转变为有活性的阿糖胞苷单磷酸再转变为阿糖胞苷二磷酸和阿糖胞苷三磷酸而起作用。阿糖胞苷二磷酸能抑制二磷酸胞苷转变为二磷酸脱氧胞苷，从而抑制细胞DNA聚合及合成。阿糖胞苷三磷酸抑制DNA多聚酶的合成，干扰核苷酸渗入DNA，阻止核苷酸延迟。
阿糖胞苷属于作用于细胞S期的周期性特异性药物，对处于S增殖期细胞的作用最为敏感，对抑制RNA及蛋白质合成的作用较弱。现今大剂量阿糖胞苷主要用于急性白血病和淋巴瘤的治疗，尤其对于急性髓细胞性白血病疗效较好，但临床数据表明，仍有较多患者病情不能缓解或缓解后复发，除患者个体差异外，耐药问题可能是其中的重要原因。
三、AraC代谢途径及相关代谢酶
AraC经细胞膜上的人类平衡型核苷转运体(human equilibra tive nucleoside transporter,hENT)进入细胞内，在脱氧胞苷激酶(DCK)的催化下形成一磷酸AraC(Ara—CMP)，再磷酸化形成具有生物活性的代谢产物Ara—CTP，后者与内源性的dCTP产生酶的竞争性作用，抑制DNA聚合酶，影响DNA合成从而发挥细胞毒作用。细胞内的AraC 又在胞苷脱氨酶(cytidine deaminase,CDA)的催化下水解脱氨转化为失活形式—AraU，其中DCK是AraC活化过程中的限速酶 。
（一）DCK的结构、基因定位和生物学作用。
编码DCK基因位于4ql3.3，含有7个外显子。DCK基因表达的增强子含有一些与转录因子(SP1,E2F)结合的位点。DCK是胞质蛋白，但过表达时则主要定位于细胞核内。研究发现，在一些DCK高表达的AML和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的样本中存在DCK的细胞核内定位，但在那些DCK低表达的样本中则没有发现核内定位。DCK的表达具有组织特异性，主要表达在淋巴组织中，尤其是在胸腺及T淋巴细胞白血病中的活性最高。
DCK是脱氧核苷酸生物合成补救途径中的关键酶，在维持正常的脱氧核苷库方面起着重要的生理学作用。DCK显示出广泛的底物特异性，除了自然产生的dAdo、dGuo、dCyd外，还能使包括 AraC、CNDAC在内的许多核苷类似物抗肿瘤药物磷酸化，这些药物只有在磷酸化后才能被活化，发挥细胞毒性作用。
（二）CDA的结构、基因定位和生物学作用。
编码CDA的基因定位于1p36.2-p35，由4个外显子及一些可变剪接信号组成。CDA的表达在不同组织或种群之间的差异很大，人类的肝细胞中CDA的活性较高 。CDA是涉及嘧啶代谢途径的代谢酶，催化胞嘧啶和脱氧胞嘧啶水解脱氨转化为相对应的尿嘧啶和脱氧尿嘧啶。在一些抗肿瘤的胞嘧啶核苷酸衍生物的代谢过程中起重要作用，可以使上述抗肿瘤药物失活。
（三）hENT的结构、基因定位及生物学作用
已证实，hENT有4种亚型(hENTl～4)，由solute carrier family 29(SLC29)编码，SLC29A1—4分别定位于6p21.1-p21.2、l1q13、10q22.1、7p22，hENT1～2由456个氨基酸残基组成，相对分子质量为50 200。它的N端位于细胞内(含有12个氨基酸)，C端位于细胞外(含有4个氨基酸)。hENT1与hENT2有50个氨基酸序列相同，有多个疏水区和亲水区，由氨基酸的肽段形成11个疏水的跨膜a螺旋(transmembrane helices,TM)。
TM1～TM2的环是糖基化位点，是hENT的次要功能区，该区域的点突变及糖基化改变能影响它的功能。TM6～TM7的环可作为免疫组织化学的特异性单克隆抗体结合部位。hENT的TM3～TM6即第 110～225个氨基酸是转运核苷的主要功能区，也是硝基苄巯基嘌呤核糖核苷(NBMPR)、氯汞基苯磺酸盐(pCMBS)、双嘧达莫和地拉草等抑制剂的作用位点，其间的点突变可改变其转运功能及对抑制物的敏感性。hENT几乎分布于迄今发现的所有细胞中，包括原核、真核生物。在人类的红细胞，胎盘、肝脏、心脏、肺脏、脾脏、睾丸、肾脏、结肠、脑 等组织的细胞膜上尤为丰富。
hENT介导核酸的顺浓度差的易化扩散，速度快，其动力为细胞膜内外的药物浓度梯度，细胞内的核酸可通过此通道向外逆流。
四、AraC代谢酶活性对临床疗效的影响
AraC虽然是治疗AML的一线药物，但是对于复发难治的患者的疗效不甚乐观。有研究表明，AraC耐药可能是导致化疗无效的主要原因。AraC进人体内产生细胞毒性作用离不开上述3种代谢酶的作用，因此代谢酶含量的变化及因编码基因的异常而产生的异常剪接的蛋白均可影响AraC的作用，从而影响临床疗效 。
（一）DCK活性对临床疗效的影响。
DCK是AraC活化过程中的限速酶，因此DCK活性、结构及含量改变被认为是导致AraC耐药的主要原因。研究发现，在各类白血病细胞中蛋白质磷酸化状态的改变可以调控DCK的活性，在慢性B淋巴细胞白血病细胞中Ser-74的磷酸化可以增强DCK的活性，同时联合使用适当的化疗药物，例如依托泊苷(VP16)、胞苷脱氨酶(CdA)等，可以促进Ser-74的磷酸化，进而提高核苷类似物的临床疗效。
同时在一系列AraC耐药的AML患者细胞中发现了可改变剪接的DCK片段，提示这些灭活的DCK片段可能与AraC耐药有关。在耐药的AML患者的原始细胞中存在4个不同可改变剪接的DCK基因与野生型DCK基因共表达。这4个片段编码的DCK的相对分子质量较小，在体外实验中被证实是无活性的。这些异常片段在化疗敏感的患者体内几乎检测不到。在缺乏野生型DCK基因的细胞株中导入可改变剪接的片段并不能使其重获AraC敏感性，但是上述无活性的片段在与野生型DCK共表达时并没有对野生型DCK基因产生长期主导的负调控作用，因此剪接异常导致上述异常片段的产生可能只是AraC耐药的一个旁副现象，并不是耐药的主要原因。研究发现，在DCK基因的5’调节区存在2个高等位基因频率的单核苷酸多态性(SNPs，-201C>T和-360C>G)，可以导致基因的连接不稳定性增加。
研究人员分析了122例AML患者的DCK调节区的单核苷酸多态性(rSNP)与临床疗效之间的关系，临床效较好的57例在应用1个疗程IA方案(去甲氧柔红霉素（6mg•m-2•d-1×3d+AraC 100mg•m2•d-1×7d)化疗后达到完全缓解，另外65例疗效不尽如人意，其中31例在使用2～3个疗程IA方案后才达到完全缓解，l3例在应用3个疗程的IA方案后仍未完全缓解，l4例出现早期复发，7例应用1个疗程的IA方案后出现持续性的骨髓抑制而死亡。两组间临床疗效、年龄、性别、FAB分型、染色体组型、初发时白细胞计数、骨髓中原始细胞的比例的差异无统计学意义(P值均>0.05)，但是两组间DCK调节区的rSNP的差异有统计学意义(P>0.05)，-360G/-201T基因型患者的临床疗效较好，而-360C/-201C基因型则提示疗效欠佳。因此，rSNP与临床疗效(无论是早期的诱导缓解率还是长期随访的无病生存率)有关，且是提示药物疗效的独立预后因子。此外，还发现-360CG/-201CT和-360GG/-201TT基因型的患者的细胞内DCK mRNA水平高于其他基因型的患者，临床疗效也较好。
研究人员还发现DCK基因调节区的SNP可以作为一个提示临床疗效的基因标记物，并可应用于指导不同患者的个体化化疗方案的制定。对于那些提示疗效不佳的rSNP的患者可以加大AraC的用量，加用作用机制完全不同的其他细胞毒性药物[如VP16、如替尼泊苷(VM26)等]或早期进行骨髓移植。
（二）hENT活性对临床疗效影响。
AraC产生细胞毒性作用首先需要hENT将其转运至细胞内，然后再由其他代谢酶作用转化成活性形式—Ara—CTP。因此，hENT的含量或结构的改变均会导致AraC转运受限，从而降低了细胞毒性作用。婴儿型AIL的淋巴细胞的基因重排率较高，对化疗应差，预后不佳，但是对于AraC却是高度敏感。研究人员在实验中发现，婴儿型AII患者的体内hENT1 mRNA的含量是儿童AII患者的2.5倍，同时对AraC的敏感性更高，这可能是因为hENT1在细胞膜表达增高可以使更多的AraC被转运至细胞内，从而被进一步磷酸化至活性形式Ara—CTP，产生相应作用，该实验结果提示hENT1 mRNA含量可以作为评价AraC敏感性较为有价值的预示指标。
同时研究发现，在慢性淋巴细胞白血病中应用白细胞介素IL-4可以提高hENTl mRNA表达水平，但是对转运活性却没有影响，这可能是因为hENTl需要转录后修饰才能被活化。可是IL-4不影响正常B淋巴细胞内hENT1的表达，因为白血病细胞表达更多的IL-4受体。实验还证实，应用蛋白激酶C(PKC)刺激经IL-4治疗的慢性淋巴细胞可以明显提高细胞对尿嘧啶的摄取，提示IL-4可使hENT1 mRNA表达水平升高，PKC对hENT1mRNA转录后修饰起了作用，从而提高了hENT1的活性。也有文献报道，长时间的PKC刺激又能抑制hENT1的转运活性。又有研究者在核苷转运体缺陷的T淋巴细胞白血病细胞株内发现了1个导致hENT1的TM1的第24位甘氨酸突变为精氨酸的点突变，从而影响了核苷的摄取，导致AraC的耐药。第24位甘氨酸在hENT的4个不同亚型中高度保守，提示它对hENT1产生正常功能的重要性。突变型hENT1仍能定位在细胞膜上，但它却不能与抑制剂NBMPR结合，表明该突变使hENT1空间结构发生改变，导致核苷及核苷类似物与hENT1结合受限。另有研究者在AraC耐药的细胞株中发现，hENT1基因突变产生异常剪接的mRNA及异常的蛋白翻译，提示可能与AraC耐药有关。
（三）CDA活性对临床疗效的影响。
CDA可使体内的AraC水解脱氨基降解为AraU，使其丧失细胞毒性作用，从而影响疗效。研究发现，在编码CDA的核心区域的3个不同的SNP-A79C、G208A和T435C，其中G208A是新近发现的，它使保守的催化区域中的丙氨酸突变为苏氨酸(A70T)，这一突变可以灭活CDA的活性。将这一CDA基因转入无CDA基因的酵母突变株内，应用AraC治疗后的AraC的半数抑制率(IC50)值明显低于原型，提示A7OT这一突变使细胞对AraC治疗更敏感。研究者运用半定量的逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)证实合并唐氏综合征的AML患儿的原始细胞内CDA的转录水平较未合并唐氏综合征的AML患儿降低73.0％，CDA表达降低使得细胞内Ara—CTP含量升高，同时细胞对AraC的敏感性也随之提高。
（四）上述代谢酶的联合作用对临床疗效的影响。
对于AraC的耐药机制已有详尽的阐述，例如CDA使灭活的AraC增加，减少AraC的细胞内渗入，减少DCK对AraC的激活。通过5’核苷酸酶增加细胞内AraC的降解、细胞内脱氧核苷池的不稳定性及受损DNA的修复功能等，但这些研究都只是关注单一的耐药机制。研究人员通过研究人类淋巴细胞H9细胞株对AraC的反应发现，其耐药作用并非源于单一代谢酶的异常，并证实可能的耐药机制为ENT1及DCK的缺乏。研究人员在AraC耐药的H9细胞株中发现转录因子SP1表达水平较低，导致DCK及hENT表达降低，产生耐药作用。
通过实时定量RT—PCR技术分析婴儿型AII患儿细胞内hENT1 mRNA水平较高，但DCK含量却较儿童型AII患儿降低66.7，其中hENT1 mRNA表达含量与AraC耐药高度有关，而DCK mRNA表达含量与耐药仅有轻微的关联。研究者通过对AraC耐药的NALM-6白血病细胞株的研究发现，细胞hENTl mRNA表达及AraC的摄取在早期(AraC浓度为0.03µmol/L)就显著减少，DCK表达减少而CDA的表达增加出现在耐药的晚期(AraC浓度为0.1µmol/L)，由此可见hENT1mRNA表达及功能是AraC耐药的主要原因，DCK及CDA表达的改变只出现于高浓度AraC作用时。
（五）Ara—CTP含量对临床疗效的影响。
AraC代谢酶基因表达的不同，直接影响到AraC在细胞内的代谢，导致其活性形式Ara—CTP含量的改变，从而影响AraC的临床疗效。研究发现在对复发难治白血病患者原代细胞的研究中发现，使用AraC后DCK的表达对细胞内Ara—CTP含量的变化没有直接影响，但是DCK与 CNⅡ(cytosolic 5’-nucleotidase II；胞质 5’核苷酸酶Ⅱ参与维持细胞内核苷酸库的平衡)的比率不同，细胞内Ara—CTP的含量也不同。DCK与CN1I的比率低则细胞内Ara—CTP含量降低，临床上对AraC的反应较差，反之亦然。同时这一发现在HL-60细胞株内也被证实。由此我们可以将白血病细胞DCK与CN11表达的比率作为预测AraC临床疗效的有效因素。
五、展望
由于AraC耐药现象随着它的广泛应用而日益显著，在儿童髓性白血病的临床治疗上往往使用大剂量的AraC进行治疗，但是当AraC治疗达到一定效果时，它的细胞毒性和髓外毒性也相应增加，各种毒副作用也相应出现，所以如何将AraC相关代谢酶的活性表达作为调整AraC药物血浓度有效参考指标值得进一步研究，通过有效的指标指示，根据个体差异，来制定合适的临床AraC用药剂量，发挥最好疗效，减少或避免药物的毒副作用。
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